Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Популярная информация
для пациентов

Полимеразная цепная реакция (ПЦР): что это за метод, как работает, компоненты реакции, применение ПЦР, преимущества

Полимеразная цепная реакция (ПЦР): что это за метод, как работает, компоненты реакции, применение ПЦР, преимущества

Наверное, каждый врач сталкивался в своей практике с такими случаями — никакой явновыраженной сиптоматики, микробиологические исследования — в пределах нормы, а у пациента температура две недели не падает, или простатит рецидивирующий, или еще какая-то болячка, с которой не удается справиться. А истинную причину выяснить ну никак не удается. Мистика? Непрофессионализм? Нет. Это недостатки диагностики. Иногда вирус или бактерия могут находиться в крови столь малых количествах, что чувствительность традиционных методов диагностики не позволяет их выявить.

А они, тем временем, делают свое темное дело, нанося порою непоправимый вред организму. Но ситуация меняется. теперь на вооружении у врачей есть тонкий высокочувствительный метод диагностики — полимеразная цепная реакция (ПЦР).

В настоящее время ПЦР является самым чувствительным и самым точным методом диагностики инфекционных заболеваний.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

— экспериментальный метод молекулярной биологии, который позволяет получить значительное увеличение количества определенных участков ДНК из биологических проб, в которых исходная ДНК содержится в сверхмалых количествах.

Помимо амплификации ДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами – расщепление или сращивание участков ДНК, введение мутаций. Поэтому метод ПЦР нашел свое практическое применение в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний, определении отцовства , в клонировании и в генной инженерии.

Первые опыты по амплификации ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК, названных праймерами, проводил еще норвежский ученый Хьеллю Клеппе в 70-е годы прошлого столетия. Но его идея так и осталась нереализованной. И только спустя почти десять лет, в 1983 году полимеразная цепная реакция была открыта американским биохимиком Кэри Муллисом. Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНКполимеразы. Первая публикация по методу ПЦР появилась в ноябре 1985 года в журнале Science. А через восемь лет К.Муллис получил Нобелевскую премию за открытый им метод.

ЧТО такое ПЦР

Каждый живой организм имеет определенный набор специфичных, присущих только ему участков ДНК. Метод ПЦР позволяет найти в исследуемом материале среди огромного количества генетической информации именно такие специфичные участки и многократно их размножить.

Метод ПЦР основан на принципе естественной репликации ДНК, включающем расплетение двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и комплиментарное дополнение обеих. Репликация ДНК начинается только в определенных местах, где расположены стартовые блоки, а не в любой произвольной точке. Суть метода заключается в том, что маркировав стартовыми блоками специфичные участки ДНК, характерные только для данного вида, можно многократно воспроизвести (амплифицировать) именно этот участок ДНК. В результате нарабатывается достаточное количество генетического материала для последующей детекции. Метод ПЦР настолько точен, что он позволяет не только выявлять наличие ДНК возбудителя в биологической пробе, но и точно установить его количество и генотипическую принадлежность.

КАК работает ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, с помощью ПЦР можно амплифицировать относительно короткие участки ДНК, длиной не более 3000 пар оснований. Используя смеси различных полимераз, специальных катализаторов и соблюдая особые условия, исследователям удавалось амплифицировать с помощью ПЦР фрагменты ДНК длиной 20-40 тыс. пар оснований. Но это все равно ничтожно мало в сравнении с длиной хромосомной ДНК эукариотической клетки. Геном человека, например, состоит примерно из 3 млрд. пар оснований.

Для того, что бы провести анализ методом ПЦР, необходимо иметь в наличии короткие одноцепочечные участки ДНК, специфичные для данного вида возбудителя, называемые «праймерами».

Но специфичного участка длиной в несколько тысяч оснований вполне достаточно, что бы дифференцировать тип возбудителя.

Для проведения ПЦР вначале исследуемый материал нагревают до температуры денатурации, добиваясь того, что бы двухцепочечные молекулы ДНК исходного материала разделились на одиночные нити. Затем вносят праймеры. При внесении праймеров в раствор с исследуемым материалом, праймеры начинают «прочесывать» раствор в поисках участков, к которым они являются комплиментарными. Если такие участки найдены – то праймеры присоединяются к ним, образовав стартовые двухниточные участки.

После присоединения праймера (этот процесс называют «отжиг») начинается синтез маркированного специфического участка ДНК с помощью специфического фермента – Taq-полимеразы, который получают из термофильных бактерий. Вновь синтезированные фрагменты ДНК становятся матрицами для синтеза новых участков ДНК в последующих циклах амплификации. Поэтому такая реакция и называется цепной. В результате 25 циклов амплификации из одного участка ДНК синтезируется 106 копий. А после 30-40 циклов нарабатывается достаточное количество ДНК, что бы визуально учитывать результаты реакции после электрофореза в агарозном геле.

КОМПОНЕНТЫ реакции ПЦР

TORCH инфекции это

Подробнее...

Проведение анализа исследуемого материала методом ПЦР состоит из 3 этапов:

  • Подготовка материала для ПЦР путем разделения и изоляции ДНК и РНК
  • Собственно проведение полимеразной цепной реакции
  • Детекция продукта ПЦР

Для проведения ПЦР необходимы следующие компоненты:

  • ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.
  • Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.
  • Термостабильная ДНК-полимераза – фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК.

Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофильных бактерий – Thermus aquaticus (Taqполимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.

  • Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
  • Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.
  • Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора.

Содержит соли, бычий сывороточный альбумин. Может быть использовано высококипящее минеральное масло (например, вазелиновое). Но это зависит от амплификатора, в котором проводится реакция. Если это амплификатор с подогреваемой крышкой, исключающий испарение реакционного раствора, то масло в пробирку не добавляется.

Также необязательным компонентом является пирофосфатаза. Этот фермент катализирует гидролиз побочного продукта реакции – пирофосфата, который может ингибировать полимеразную цепную реакцию.

ПРИМЕНЕНИЕ ПЦР

ПЦР – диагностика универсальна. Для проведения анализа методом ПЦР используется любой биологический материал, в котором может содержаться ДНК возбудителя – слизи, моча, кровь, мокрота, соскобы и биоптаты.

широкое распространение получил метод ПЦР для выявления инфекций, передаваемых половым путем, особенно скрытых или хронических. Это такие инфекции как хламидиоз, гарднереллез, микоплазменная инфекция и пр. Это возбудители, которых сложно выявить классическим способом выращивания клеток в лабораторных условиях. Да и анализ антител в серологическом растворе может быть неточным.

А исследовав соскоб эпителия уретры или канала шейки матки, секрет простаты или мочу, можно с точностью установить наличие именно той или иной инфекции, так как размножению подвергается только ДНК бактерии, а не сама бактерия.

Также метод ПЦР незаменим для диагностики вирусных заболеваний. Кроме выявления наличия вируса в пробе, ПЦР позволяет определять генотип вируса. Что очень важно, например, при выборе методов лечения папилломавируса человека и прогнозирования развития заболевания, т.к. вирусы ВПЧ, принадлежащие к разным типам, обладают различной патогенностью и онкогенностю. Также генотипирование важно при диагностике вирусных гепатитов. Метод ПЦР используется для контроля за эффективностью лечения при вирусных гепатитах. Для этого производится так называемый «количественный» анализ, который позволяет не только выявить наличие вирусной ДНК, но и с точностью определить количество вирусов, содержащихся в крови.

Не стоит забывать и о диагностике ВИЧ-инфекции.

Метод ПЦР нашел свое применение в пульмонологии, где он используется для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулеза, дифтерии.

Метод может быть применен для выявления хеликобактериоза в гастроэнтерологии, для определения цитомегаловирусной инфекции и онковирусов.

Но выявление инфекционных заболеваний, оценка их вирулентности и устойчивости к антибиотикам – это только одна из возможностей ПЦРдиагностики. Она позволяет также проводить генетическую дактилоскопию, пренатальную диагностику и многое другое.

Современные методы пренатальной диагностики или скрининга носительства призваны помочь решить проблему детской смертности и инвалидности, связанной с развитием у детей наследственных болезней, наследственной предрасположенности к некоторым видам смертельных недугов (например, к раку). Именно ПЦР является тем методом, который позволяет выявить поврежденные участки ДНК, связанные с точечными мутациями генов, и влекущие страшные последствия.

Несмотря на то, что ПЦРдиагностика является высокоспецифичным методом, при ней также возможны ложно-положительные результаты, связанные с попаданием в материал исследования чужой ДНК и ее копий через предметы и реагенты. Предупреждается это правильной организацией исследования и соблюдением ряда правил.

ПРЕИМУЩЕСТВА

ПЦР выявляет инфекции

Подробнее...

Метод ПЦР стал «золотым стандартом» при диагностике ряда заболеваний.

Главное преимущества метода – это его чувствительность. ПЦР позволяет выявить возбудителей в тех случаях, когда из за сверхмалого количества они недоступны для других методов.

Благодаря особенности ПЦР, позволяющей выявлять даже единичные экземпляры возбудителей в биологическом материале, метод особенно ценен в диагностике латентных и хронических форм заболеваний.

Возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов очень сложно обнаружить другими методами, а ПЦР дает такую возможность.

Также огромным достоинством метода является его быстрота, т.к весь процесс, начиная с выделения вирусной или бактериальной ДНК из пробы, занимает всего несколько часов. В то время, как трудоемкий метод выращивания визуализируемых колоний возбудителя в лабораторных условиях может занимать несколько дней. Практически полная автоматизация метода сводит к минимуму вероятность ошибок, связанных с ручной подготовкой и тестированием проб.

Метод эффективен при диагностике трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм патогенных бактерий.

Также метод может быть использован для тестирования объектов внешней среды.

Специфичность метода составляет 100%.

Метод используется не только в диагностике, но и в наблюдении за динамикой течения заболеваний, т.к. позволяет определять число копий возбудителя в пробе и, тем самым, контролировать виремию или бактеремию в процессе лечения. Что позволяет своевременно оценить эффективность лечения и произвести необходимые корректировки.

Очень важно, что при проведении исследования методом ПЦР практически исключается возможность инфицирования персонала во время проведения анализа, т.к. исследуемый материал может быть дезинфицирован химически или термически в момент забора.



ПЦР

ПЦР диагностика: что это? Полимеразная цепная реакция в диагностике урогенитальных инфекций

С начала нового века в медицинской практике все большее применение находит метод исследования ПЦР (полимеразная цепная реакция), характеризующаяся высокой чувствительностью и специфичностью

Подробнее...

Внимание! информация на сайте не является медицинским диагнозом, или руководством к действию и предназначена только для ознакомления.

Популярная информация
для пациентов


Внимание! Все материалы размещенные на странице не являются рекламой,
а есть не что иное как мнение самого автора,
которое может не совпадать с мнением других людей и юридических лиц!

Материалы, предоставленные на сайте, собраны из открытых источников и носят ознакомительный характер. Все права на данные материалы принадлежат их законным правообладателям. В случае обнаружения нарушения авторских прав - просьба сообщить через обратную связь. Внимание! Вся информация и материалы, размещенные на данном сайте, представлены без гарантии того, что они не могут содержать ошибок.
Есть противопоказания, необходимо проконсультироваться со специалистом!

имеются противопоказания